Date: 2023-11-24

Degree: Doctoral Thesis

Programme: Doctor of Science

Authors: Muhammad Bashir Saidu

Supervisors: Professor David Gonçalves, University of Saint Joseph, Professor Paula M. L. Castro, Universidade Católica Portuguesa, and Professor Irina Sousa Moreira, Universidade Católica Portuguesa

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Abstract:

The demand for plastic has led to enormous plastic waste in the environment, which persist and negatively impact the ecosystems. Polyethylene terephthalate (PET) is one of the most common thermoplastic polymers available on the market. The concerns about plastic waste generated an interest in strategies to enhance its biodegradation and finding alternative polymers. In this work was investigated the possibility of using bacteria to degrade PET and to produce bioplastics (Polyhydroxyalkanoates, PHAs). Finally, the integration of the two processes was tested. Overall, the work aimed to investigate the potential to recycle PET into bioplastic using bacteria.

The potential of bacterial consortia from various environmental samples to degrade PET granules in liquid matrix was investigated. . The results revealed maximum PET granules degradation of 1.1 % by one of the tested consortia. PET degradation intermediate terephthalic acid (TPA) was not detected at the end of 55 days. Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) results showed major spectral peak shifts and bends on PET chemical structure compared to non-inoculated control.

The biodegradation of PET films buried in the soil (A), with mangrove plants (B), and bioaugmented with a bacterial consortium (C) was also investigated. The experiments were conducted for 240 days at ambient conditions. The results revealed no difference between treatments in the degradation, with a maximum weight loss of 0.118 % in the bioaugmented treatment. Nevertheless, Scanning Electron Microscope (SEM) and FTIR results indicated significant surface changes, spectral peak shifts, and stretches in PET chemical structures. Bacterial consortia isolated from the soil of the experimental treatments were assessed for degradation of PET monomers, TPA and monoethylene glycol (MEG), and intermediate Bis(2-hydroxyethyl) terephthalate (BHET). The consortia were inoculated in flasks containing minimal media with 1000 mg/L TPA or BHET or1113 mg/L MEG as the sole carbon source. Results showed complete degradation of TPA and significant degradation of BHET (96.09%), and MEG (83.65%) by the consortia. 

In the second part of the study, bacteria were isolated from various environmental samples and screened for PHA production using Sudan Black B staining on colonies and smeared glass slides. Transmission Electron Microscope images were captured to confirm the intracellular PHA inclusions. A total of 35 isolates were screened for PHA, and 22 showed positive staining. The isolate showing higher levels of PHA synthesis (EC2-30-3) was identified based on 16S rRNA gene sequence as Bacillus sp. and selected for PET monomers degradation and fermentation cultures for PHA production. It was cultured in minimal media with 1000 mg/L TPA and 1113 mg/L MEG as the carbon source for eight days. The isolate grew better in media containing MEG, which was selected as a substrate model for PHA fermentation. To integrate PET monomers biodegradation and production of PHA, the isolate was cultured in 0.2 % MEG. A control with 0.2 % of glucose was prepared, and the cultures were incubated for 96 hours. Bacillus sp. EC2-30-3 showed higher PHA accumulation in media supplied with MEG (40.31%) than glucose (25.53%). This is the first report showing that Bacillus sp. uses PET monomer as carbon source to produce a biopolymer. FTIR results of the extracted PHA identified its functional units as C–H, CH3, C=O, and C–O groups. The absorption bands obtained are closely related to the structure of PHB. The study thus confirmed the ability of the isolated bacteria to degrade PET monomers and produce biopolymers.

The results of this work open the possibility for upscaling the use of bacteria to mitigate the impact of PET on the environment while producing environmentally friendly bioplastics.

Keywords: Polyethylene terephthalate, Polyhydroxyalkanoates, mangroves, biodegradation, bacteria.

(Português)

Sumário:

A procura por plásticos tem gerado enormes quantidades destes resíduos no meio ambiente, os quais persistem e impactam negativamente os ecossistemas. O polietileno tereftalato (PET) é um dos polímeros termoplásticos mais comuns no mercado. A preocupação com os resíduos plásticos motiva o desenvolvimento de estratégias para aumentar a biodegradação e encontrar polímeros alternativos. Neste trabalho foi investigada a possibilidade de usar bactérias para degradar PET e para produzir bioplásticos (polihidroxialcanoatos, PHAs). Por fim, foi testada a integração dos dois processos. No geral, o trabalho teve como objetivo investigar o potencial de reciclar PET em bioplástico usando bactérias.

O potencial de consórcios bacterianos obtidos de várias amostras ambientais para degradar grânulos de PET em matriz líquida foi investigado. Os resultados revelaram degradação máxima de 1,1% por um dos consórcios testados. O intermediário de degradação do PET, ácido tereftálico (TPA), não foi detetado ao final de 55 dias. Os resultados da espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) mostraram grandes desvios e curvas espectrais na estrutura química do PET em comparação com o controlo não inoculado.

A biodegradação de filmes de PET enterrados no solo (A), e com plantas de mangal (B), e bioaumentados com um consórcio bacteriano (C) também foi investigada. Os ensaios foram conduzidos por 240 dias em condições ambientais. Os resultados não revelaram diferenças entre os tratamentos na degradação, com uma perda de peso máxima de 0,118% no tratamento com bioaumento. No entanto, os resultados do Microscópio Eletrônico de Varredura (SEM) e FTIR indicaram mudanças significativas na superfície, deslocamentos de pico espectrais e extensões nas estruturas químicas do PET. Consórcios bacterianos isolados do solo dos tratamentos experimentais foram avaliados quanto à degradação dos monômeros de PET, TPA e monoetilenoglicol (MEG), e intermediário Bis (2-hidroxietil) tereftalato (BHET). Os consórcios foram inoculados em meio mínimo com 1000 mg/L TPA ou BHET ou 1113 mg/L MEG como fontes de carbono. Os resultados mostraram degradação completa de TPA e degradação significativa de BHET (96,09%) e MEG (83,65%) pelos consórcios. 

Na segunda parte do estudo, foram isoladas bactérias de várias amostras ambientais e triadas quanto à produção de PHA usando a coloração Sudan Black B.  Foram capturadas imagens com Microscópio Eletrônico de Transmissão para confirmar as inclusões de PHA intracelular. Um total de 35 isolados foram rastreados para PHA, e 22 mostraram coloração positiva. O isolado que apresentou maiores níveis de síntese de PHA (EC2-30-3) foi identificado com base na sequência do gene 16S rRNA como Bacillus sp. e selecionado para culturas de fermentação e degradação de monômeros de PET para produção de PHA. Foi cultivado em meio mínimo com 1000 mg/L TPA e 1113 mg/L MEG como fonte de carbono por oito dias. O isolado cresceu melhor em meio contendo MEG, que foi selecionado como modelo de substrato para fermentação de PHA. Para integrar a biodegradação dos monômeros de PET e a produção de PHA, o isolado foi cultivado em 0,2% de MEG. Um controlo com 0,2% de glicose foi preparado e as culturas foram incubadas por 96 horas. Bacillus sp. EC2-30-3 apresentou maior acumulação de PHA em meio com MEG (40,31%) do que glicose (25,53%). Este é o primeiro estudo a reportar que Bacillus sp. usa monômero de PET como carbono para produzir um biopolímero. Os resultados de FTIR do PHA extraído identificaram suas unidades funcionais como grupos C–H, CH3, C=O e C–O. As bandas de absorção obtidas estão intimamente relacionadas com a estrutura do PHB. O estudo confirmou, assim, a capacidade das bactérias isoladas em degradar monômeros de PET e produzir biopolímeros.

Os resultados deste trabalho abrem a possibilidade de aumentar o uso de bactérias para mitigar o impacto do PET no meio ambiente acoplada à produção de bioplásticos mais ecológicos.

Palavras-chave: Polietileno tereftalato, Polihidroxialcanoatos, mangal, biodegradação, bactérias.